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引 言(yan)
色(se)(se)譜(pu)法是(shi)1906年(nian)(nian)(nian)(nian)植(zhi)物學家Michael Tswett將(jiang)含有(you)有(you)色(se)(se)的(de)(de)植(zhi)物葉子色(se)(se)素(su)和溶液通(tong)過(guo)裝填有(you)白堊粒子吸(xi)附(fu)劑的(de)(de)柱子，企圖(tu)分(fen)(fen)離它們(men)時而發現(xian)并命名的(de)(de)。各(ge)種(zhong)色(se)(se)素(su)以(yi)不同的(de)(de)速率通(tong)過(guo)柱子，從而彼此分(fen)(fen)開。分(fen)(fen)離開的(de)(de)色(se)(se)素(su)形成不同的(de)(de)色(se)(se)帶而易于區分(fen)(fen)，由此得名為色(se)(se)譜(pu)法（Chromatography），又稱層析(xi)法。其(qi)后的(de)(de)一個重(zhong)大進展是(shi)1941年(nian)(nian)(nian)(nian)Martin和Synge 發現(xian)了(le)液－液（分(fen)(fen)配(pei)）色(se)(se)譜(pu)法[Liquid-Lipuid（partition）Chromatography，簡(jian)稱LIC]。 他們(men)用(yong)(yong)覆蓋(gai)于吸(xi)附(fu)劑表(biao)面的(de)(de)并與流動(dong)相(xiang)不混溶的(de)(de)固定(ding)液來(lai)代替以(yi)前僅有(you)的(de)(de)固體吸(xi)附(fu)劑。試樣(yang)組分(fen)(fen)按照(zhao)其(qi)溶解在兩相(xiang)之(zhi)間分(fen)(fen)配(pei)。Martin和Synge因為這一工(gong)作(zuo)而榮(rong)獲1952 年(nian)(nian)(nian)(nian)諾貝爾化學獎。在使用(yong)(yong)柱色(se)(se)譜(pu)的(de)(de)早期年(nian)(nian)(nian)(nian)代，可(ke)靠地鑒(jian)定(ding)小量(liang)的(de)(de)被分(fen)(fen)離物質是(shi)困(kun)難的(de)(de)，所以(yi)研究發展了(le)紙(zhi)色(se)(se)譜(pu)法（Paper Chromatography，簡(jian)稱PC）。在這種(zhong)“平(ping)面的(de)(de)”技術中，分(fen)(fen)離主要是(shi)通(tong)過(guo)濾紙(zhi)上(shang)(shang)的(de)(de)分(fen)(fen)配(pei)來(lai)實現(xian)的(de)(de)。然(ran)后由于充分(fen)(fen)考慮了(le)平(ping)面色(se)(se)譜(pu)法的(de)(de)優點而發展了(le)薄層色(se)(se)譜(pu)法（Thin-Layer Chromatography，簡(jian)稱TLC），在這種(zhong)方法中，分(fen)(fen)離系(xi)在涂布于玻(bo)璃板(ban)或某些堅硬材料上(shang)(shang)的(de)(de)薄層吸(xi)附(fu)劑上(shang)(shang)進行。
在(zai)Stah－l于1958年(nian)進行了(le)經典性的工(gong)作(zuo)將技術和所用材料加以標準化之后，
薄(bo)層(ceng)(ceng)色(se)(se)譜法方(fang)(fang)贏(ying)得了聲譽。為(wei)了幫助提色(se)(se)譜法或薄(bo)層(ceng)(ceng)色(se)(se)譜法對離子化合(he)物的分離效率，可以(yi)向紙或板施(shi)加電場。這種改進了方(fang)(fang)法分別(bie)稱作紙上電泳或薄(bo)層(ceng)(ceng)電泳。
新(xin)近(jin)發展起來的色譜法
氣相(xiang)色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)是Martin和James于1952 年(nian)首先(xian)描(miao)述的(de)(de)(de)，現已(yi)成為所有色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)中zui廣(guang)泛使用(yong)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)種(zhong)方(fang)法(fa)(fa)，它特別適用(yong)于氣體混(hun)合(he)(he)物或揮發性液(ye)(ye)體和固體，即(ji)便對于很(hen)復雜(za)的(de)(de)(de)混(hun)合(he)(he)物，其分(fen)離(li)時間也僅為幾(ji)分(fen)鐘左右，這(zhe)已(yi)屬司(si)空見慣(guan)。高分(fen)辯率、分(fen)析迅速和檢測(ce)靈敏(min)等幾(ji)種(zhong)優點之(zhi)綜合(he)(he)使氣相(xiang)色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)成了幾(ji)乎每個化(hua)學實驗室要采用(yong)的(de)(de)(de)一(yi)(yi)種(zhong)常(chang)規方(fang)法(fa)(fa)。近(jin)年(nian)來，因為新(xin)(xin)型液(ye)(ye)相(xiang)色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)儀(yi)和新(xin)(xin)型柱(zhu)填料的(de)(de)(de)發展以及(ji)對色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)理論的(de)(de)(de)更深(shen)入了解，又重新(xin)(xin)引起對密閉柱(zhu)液(ye)(ye)相(xiang)色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)的(de)(de)(de)興(xing)趣。液(ye)(ye)相(xiang)色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)（High-Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC）迅速成為與(yu)氣相(xiang)色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)一(yi)(yi)樣廣(guang)泛使用(yong)的(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)，對于迅速分(fen)離(li)非揮發性的(de)(de)(de)或熱不穩定(ding)的(de)(de)(de)試(shi)樣來說(shuo)，液(ye)(ye)相(xiang)色(se)(se)譜(pu)(pu)(pu)(pu)(pu)法(fa)(fa)常(chang)常(chang)是更可(ke)取的(de)(de)(de)。
色譜法分類
色譜法有多種類(lei)型，也有多種分類(lei)方(fang)法。
（一）按兩相所處的狀態分類
液體作為(wei)(wei)流動相(xiang)，稱(cheng)為(wei)(wei)“液相(xiang)色譜(pu)”（liquid chromatograp-hy）；用(yong)氣(qi)體作為(wei)(wei)流動相(xiang)，稱(cheng)為(wei)(wei)“氣(qi)相(xiang)色譜(pu)”（gas
chromatogr-aphy）。固定(ding)相(xiang)也有(you)兩(liang)種狀態，以固體(ti)(ti)吸附劑作為固定(ding)相(xiang)和(he)以附載在固體(ti)(ti)上的(de)液體(ti)(ti)作為固定(ding)相(xiang)，所以層(ceng)析法按兩(liang)相(xiang)所處的(de)狀態可以分(fen)為：
; 液(ye)－固色譜（liquid-solid chromatography）
液－液色譜（liquid-liquid chromatography）
氣－固(gu)色譜（gas-solid chromatography）
氣(qi)－液色譜(pu)（gas-liquid chromatography）
（二）按(an)層析過程(cheng)的機理分(fen)類
吸附層析（adsorption chromatography ）利(li)用吸附劑表面對(dui)不同組分吸附性能(neng)的(de)(de)差異，達到分離(li)鑒(jian)定的(de)(de)目(mu)的(de)(de)。
分(fen)配層(ceng)析（partition chromatography）利用不(bu)同組分(fen)在流動(dong)相(xiang)和固(gu)定相(xiang)之間(jian)的分(fen)配系數(shu)（或溶解(jie)度(du)）不(bu)同，而使(shi)之分(fen)離的方法。
離(li)子(zi)交換層析（ion-exchange chromatography ）利用(yong)不同組分(fen)對離(li)子(zi)交換劑親和力的不同，而(er)(er)進行分(fen)離(li)的方法(fa)。凝(ning)膠層析（gelchromatography）利用(yong)某些凝(ning)膠對于不同組分(fen)因(yin)分(fen)子(zi)大小不同而(er)(er)阻(zu)滯作用(yong)不同的差異，進行分(fen)離(li)的技術。
（三）按操作形(xing)式(shi)不(bu)同(tong)分(fen)類
柱層(ceng)(ceng)(ceng)析（colum chromatography）將固定(ding)相裝于柱內，使(shi)樣(yang)(yang)品沿(yan)一(yi)個方(fang)向移動(dong)而達到(dao)分離。紙(zhi)(zhi)層(ceng)(ceng)(ceng)析（paper chrmatography）用(yong)濾(lv)紙(zhi)(zhi)作(zuo)液體(ti)的(de)載體(ti)（擔體(ti)support），點(dian)樣(yang)(yang)后，用(yong)流(liu)動(dong)相展開，以達到(dao)分離鑒定(ding)的(de)目的(de)。薄(bo)層(ceng)(ceng)(ceng)層(ceng)(ceng)(ceng)析（thin layper chromatography）將適當粒度的(de)吸附劑鋪成(cheng)薄(bo)層(ceng)(ceng)(ceng)，以紙(zhi)(zhi)層(ceng)(ceng)(ceng)析類(lei)似的(de)方(fang)法進行物質(zhi)的(de)分離和(he)鑒定(ding)。
吸附色譜(pu)法
吸附(fu)色(se)譜法(fa)常叫做(zuo)液－固色(se)譜法(fa)（Liquid-Solid
Chromatography，簡(jian)稱LSC），它(ta)是(shi)基于(yu)在溶質和用(yong)作(zuo)固(gu)(gu)定固(gu)(gu)體吸(xi)(xi)附劑(ji)上(shang)的固(gu)(gu)定活性(xing)位點(dian)之間的相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)。可以(yi)(yi)將(jiang)吸(xi)(xi)附劑(ji)裝填于(yu)柱中(zhong)、覆蓋于(yu)板上(shang)、或(huo)浸漬(zi)于(yu)多孔(kong)濾紙中(zhong)。吸(xi)(xi)附劑(ji)是(shi)具有大(da)表(biao)面(mian)積的活性(xing)多孔(kong)固(gu)(gu)體，例(li)如(ru)(ru)硅膠、氧化鋁(lv)和活性(xing)炭等。活性(xing)點(dian)位例(li)如(ru)(ru)硅膠的表(biao)面(mian)硅烷(wan)醇，一般與待分(fen)離(li)(li)化合物(wu)的極性(xing)官(guan)能團(tuan)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)。分(fen)子(zi)的非(fei)極性(xing)部分(fen)（例(li)如(ru)(ru)烴）對分(fen)離(li)(li)只有較小影(ying)響，所以(yi)(yi)液－固(gu)(gu)色譜法十(shi)分(fen)適于(yu)分(fen)離(li)(li)不(bu)同種類的化合物(wu)（例(li)如(ru)(ru)，分(fen)離(li)(li)醇類與芳香(xiang)烴）。
分配色譜(pu)法(fa)
在(zai)(zai)分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)（也稱(cheng)體(ti)(ti)液(ye)－液(ye)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)）中，溶(rong)質分(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)在(zai)(zai)兩種(zhong)(zhong)不(bu)相(xiang)(xiang)混溶(rong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)相(xiang)(xiang)即(ji)固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)相(xiang)(xiang)和流動相(xiang)(xiang)之(zhi)間按(an)照它(ta)們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)對溶(rong)解(jie)(jie)度進行分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)。固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)相(xiang)(xiang)均勻地覆蓋(gai)于惰性(xing)(xing)(xing)載體(ti)(ti)─多(duo)孔的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)或(huo)非(fei)(fei)多(duo)孔的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)固(gu)(gu)體(ti)(ti)細粒或(huo)多(duo)孔紙上(shang)（紙上(shang)譜(pu)(pu)）。為避免兩相(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)混合(he)(he)，兩種(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)液(ye)體(ti)(ti)在(zai)(zai)極性(xing)(xing)(xing)上(shang)必須顯著不(bu)同。若固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)液(ye)是(shi)極性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（例(li)(li)(li)如乙二(er)醇），流動相(xiang)(xiang)是(shi)非(fei)(fei)極性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（例(li)(li)(li)如乙烷），那么極性(xing)(xing)(xing)組分(fen)(fen)(fen)(fen)將(jiang)較(jiao)強烈的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)被(bei)保留。這(zhe)是(shi)通常(chang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)操作方(fang)(fang)式(shi)。另一(yi)方(fang)(fang)面，若固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)相(xiang)(xiang)是(shi)非(fei)(fei)極性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（例(li)(li)(li)如癸烷），流動相(xiang)(xiang)是(shi)極性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)（例(li)(li)(li)如水），則極性(xing)(xing)(xing)組分(fen)(fen)(fen)(fen)易分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)于流動相(xiang)(xiang)，從而洗脫得較(jiao)快。后一(yi)種(zhong)(zhong)方(fang)(fang)法(fa)(fa)（它(ta)有相(xiang)(xiang)反的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)極性(xing)(xing)(xing)）稱(cheng)作為反相(xiang)(xiang)液(ye)─液(ye)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)。由于溶(rong)解(jie)(jie)度差別的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)細微效應(ying)(ying)，所以液(ye)─液(ye)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)很適(shi)于分(fen)(fen)(fen)(fen)離同系物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)同分(fen)(fen)(fen)(fen)異構體(ti)(ti)。在(zai)(zai)液(ye)─液(ye)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)中，固(gu)(gu)定(ding)(ding)(ding)相(xiang)(xiang)幾乎(hu)都被(bei)化(hua)學鍵合(he)(he)在(zai)(zai)載體(ti)(ti)物質上(shang)，而不(bu)是(shi)機(ji)械覆蓋(gai)在(zai)(zai)它(ta)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)表面。這(zhe)種(zhong)(zhong)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)稱(cheng)作鍵合(he)(he)相(xiang)(xiang)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)（Bonded-Phase Chromatography，簡稱(cheng) BPC）。這(zhe)種(zhong)(zhong)方(fang)(fang)法(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)機(ji)理(li)尚不(bu)清楚，可能(neng)是(shi)分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)機(ji)理(li)，也可能(neng)是(shi)吸(xi)附機(ji)理(li)， 視實驗(yan)條件而定(ding)(ding)(ding)。液(ye)相(xiang)(xiang)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)中，鍵合(he)(he)相(xiang)(xiang)色譜(pu)(pu)法(fa)(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)應(ying)(ying)用遠遠*其他模式(shi)。
離子(zi)交換色譜法(fa)
Sober 和(he) Peterson于1956年將離子(zi)交(jiao)換基團(tuan)結(jie)合到(dao)纖(xian)維(wei)(wei)素(su)上(shang)，制成了離子(zi)交(jiao)換纖(xian)維(wei)(wei)素(su)，成功地應(ying)用于蛋白質的分(fen)離。從此使生物(wu)大分(fen)子(zi)的分(fen)級分(fen)離方法(fa)取得了迅速的發(fa)展(zhan)。離子(zi)交(jiao)換基團(tuan)不但可結(jie)合到(dao)纖(xian)維(wei)(wei)上(shang)， 還可結(jie)合到(dao)交(jiao)聯(lian)葡聚糖（S-ephadex）和(he)瓊脂糖凝膠（Sepharose）上(shang)。
近年來離(li)子交換(huan)色譜技(ji)術已經廣泛應用(yong)于蛋(dan)白質、酶、核酸(suan)、肽、寡(gua)核苷酸(suan)、病(bing)毒、噬菌(jun)體和多(duo)糖的分(fen)(fen)離(li)和純化。它們的優點(dian)是:⑴具有開放性(xing)支持骨架，大(da)(da)分(fen)(fen)子可(ke)以(yi)自由進入(ru)和迅(xun)速擴散，故吸附容量大(da)(da)。⑵具有親水性(xing)，對大(da)(da)分(fen)(fen)子的吸附不大(da)(da)牢固，用(yong)溫和條件使可(ke)以(yi)洗脫(tuo)，不致引起蛋(dan)白質變(bian)性(xing)或酶的失活。⑶多(duo)孔性(xing)，表面積大(da)(da)、交換(huan)容量大(da)(da)，回(hui)收率(lv)高，可(ke)用(yong)于分(fen)(fen)離(li)和制備。
一、基本理論
離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)通(tong)常是(shi)一種不(bu)溶(rong)(rong)性高分子(zi)(zi)化合物，如(ru)樹脂，纖(xian)維素，葡聚糖(tang)，醇脂糖(tang)等，它的(de)(de)(de)(de)(de)(de)分子(zi)(zi)中(zhong)(zhong)含有可(ke)(ke)解離(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基團，這(zhe)些基因在(zai)水溶(rong)(rong)液(ye)中(zhong)(zhong)能與(yu)溶(rong)(rong)液(ye)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)其它陽離(li)(li)子(zi)(zi)或陰(yin)離(li)(li)子(zi)(zi)起交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)作用。雖然交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)反應都是(shi)平衡反應，但(dan)在(zai)層析(xi)柱上(shang)進行(xing)時，由于連續添(tian)加新的(de)(de)(de)(de)(de)(de)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)溶(rong)(rong)液(ye)，平衡不(bu)斷(duan)按正方向進行(xing)，直至*。因此(ci)可(ke)(ke)以(yi)(yi)把離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)子(zi)(zi)離(li)(li)子(zi)(zi)全(quan)部洗脫(tuo)下(xia)來，同理，當一定量的(de)(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)液(ye)通(tong)過(guo)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)柱時，由于溶(rong)(rong)液(ye)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)(li)子(zi)(zi)不(bu)斷(duan)被(bei)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)而波(bo)度逐減(jian)少(shao)，因此(ci)也可(ke)(ke)以(yi)(yi)全(quan)部被(bei)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)并(bing)吸(xi)附(fu)在(zai)樹脂上(shang)。如(ru)果有兩(liang)種以(yi)(yi)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)成(cheng)分被(bei)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)吸(xi)著(zhu)在(zai)離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)上(shang)，用洗脫(tuo)液(ye)洗脫(tuo)時，在(zai)被(bei)洗脫(tuo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)能力則決定于各自洗反應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)平衡常數(shu)。蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)過(guo)程有兩(liang)個階段──吸(xi)附(fu)和(he)(he)解吸(xi)附(fu)。吸(xi)附(fu)在(zai)離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)可(ke)(ke)以(yi)(yi)通(tong)過(guo)改變pH使吸(xi)附(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)失去電(dian)(dian)荷而達(da)到(dao)解離(li)(li)但(dan)更多的(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)通(tong)過(guo)增加離(li)(li)子(zi)(zi)強度，使加入的(de)(de)(de)(de)(de)(de)離(li)(li)子(zi)(zi)與(yu)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)競爭離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)電(dian)(dian)荷位置，使吸(xi)附(fu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)與(yu)離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)解開(kai)。不(bu)同蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)與(yu)離(li)(li)子(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)之間形成(cheng)電(dian)(dian)鍵數(shu)目(mu)不(bu)同，即親和(he)(he)力大小有差異 ，因此(ci)只要選擇適當的(de)(de)(de)(de)(de)(de)洗脫(tuo)條件便可(ke)(ke)將混合物中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)組(zu)分逐個洗脫(tuo)下(xia)來，達(da)到(dao)分離(li)(li)純化的(de)(de)(de)(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)。
二、離子交換的分(fen)類及常見(jian)種類
（一）分類
離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)分(fen)為(wei)兩大類，即(ji)陽離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)和陰(yin)離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)。各類交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)根據其(qi)解離(li)性大小，還可分(fen)為(wei)強、弱兩種，即(ji) 強酸(suan)劑(ji) 陽離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)
弱(ruo)酸劑(ji) 強鹼(jian)型 陰(yin)離子交換(huan)劑(ji) 弱(ruo)鹼(jian)型 。
1.陽離子交換劑
陽(yang)離(li)子交換劑中(zhong)的(de)可解(jie)離(li)基(ji)因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、 羧酸（COOH）和酚(fen)羥(qian)基(ji)（-OH）等酸性基(ji)。
某些交(jiao)換劑(ji)在交(jiao)換時反應如下：
強酸性：R-SO3 -H+ ＋ Na+ R-SO3- Na+H+
弱(ruo)酸性：R-COOH＋Na+ R-COONa ＋H+
國產樹(shu)脂中(zhong)強酸(suan)1×7（上海樹(shu)脂＃732）和國外(wai)產品(pin)Dowex 50、Zerolit 225等(deng)都于(yu)強酸(suan)型離子交換(huan)劑。
2.陰離子交換劑(ji)
陰離(li)子交換劑中的可解離(li)基因(yin)是伯胺(an)、（-NH2）、仲胺(an)（-NHCH3）、叔胺(an)[N-（CH3）2]和季(ji)胺(an)[-N（CH3）2]等鹼性基團。某些交換反(fan)應如(ru)下：
強鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 Cl＋OH-
弱鹼性：R-N+（CH3）2 H·OH- ＋Cl R-N+（CH3）2 HCl＋OH-
強鹼(jian)性(xing)＃201號國(guo)(guo)產(chan)樹脂和(he)國(guo)(guo)外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都屬于強鹼(jian)型陰離子(zi)交換劑。
（二）種類(lei)
1.纖維(wei)素離子交換(huan)(huan)劑(ji)(ji)(ji)：陽(yang)離子交換(huan)(huan)劑(ji)(ji)(ji)有(you)羥甲基(ji)纖維(wei)素（CM-纖維(wei)素）， 陰離子交換(huan)(huan)劑(ji)(ji)(ji)有(you)氯(lv)代三乙胺纖維(wei)紗（DESE-纖維(wei)素）。
2.交(jiao)聯(lian)(lian)葡聚糖(tang)離(li)子(zi)(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)(ji)：是將交(jiao)換(huan)(huan)基因連(lian)接到交(jiao)聯(lian)(lian)葡聚糖(tang)上制成的(de)一(yi)類交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)(ji)，因而既具(ju)有(you)離(li)子(zi)(zi)交(jiao)換(huan)(huan)作用，又具(ju)有(you)分(fen)子(zi)(zi)篩(shai)效應，是一(yi)類廣泛(fan)應用的(de)色譜分(fen)離(li)物質(zhi)。常用的(de)Sephadex離(li)子(zi)(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)(ji)也有(you)陰離(li)子(zi)(zi)和陽離(li)子(zi)(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)(ji)兩類。陰離(li)子(zi)(zi)交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)(ji)有(you)DEAE-Sephadex
; A-25，A-50和(he)QAE- Sephadex A25 ， A50 ； 陽離子交(jiao)換劑(ji)有CM-Sephaetx
C-50，C-50和Sephadex
C-25，C-50。陰離子交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)用英文字頭A，陽離子交(jiao)換(huan)(huan)劑(ji)的英文字頭是C。英文字后面的數字表示Sephadex型(xing)號。
3.瓊脂糖(tang)離子離交換劑(ji)：是將DESE-或(huo)CM-基團附著在Sepharose CL-6B
上(shang)形成，DEAE-Sephades（陰(yin)離(li)子）和CM-Sepharose（陽離(li)子），具有硬度大，
性質穩定，凝膠后的流速好(hao)，分(fen)離能力(li)強等優點。
三、實驗操作
（一）交換(huan)劑的處理(li)，再生(sheng)與轉型
新出廠的樹(shu)脂是干樹(shu)脂，要(yao)用水浸透(tou)使之充分吸水膨脹。因其含有政績(ji)一(yi)些雜(za)質，所(suo)要(yao)要(yao)用水、酸、鹼洗滌。一(yi)般手(shou)續如下：新出廠干樹(shu)脂用水浸泡2
小時(shi)后減(jian)抽壓去氣(qi)泡，傾去水，再用大(da)量無離子(zi)水洗至澄清(qing)，去水后加(jia)4倍(bei)量2N HCl攪抖4小時(shi)，除去酸液，水洗到中性，再加(jia)4倍(bei)量2N
NaOH攪抖4小時，除(chu)鹼液(ye)，
水洗(xi)到中性備用。將樹脂(zhi)(zhi)帶(dai)(dai)(dai)(dai)上(shang)所(suo)希(xi)(xi)望(wang)(wang)(wang)的某(mou)種離子的操作稱為(wei)轉型。如希(xi)(xi)望(wang)(wang)(wang)陽樹脂(zhi)(zhi)帶(dai)(dai)(dai)(dai)Na+，則(ze)用4倍量NaOH攪拌浸泡2小時(shi)以上(shang)；如希(xi)(xi)望(wang)(wang)(wang)樹脂(zhi)(zhi)帶(dai)(dai)(dai)(dai)H+，可(ke)用HCl處理。陰樹脂(zhi)(zhi)轉型也同樣，若(ruo)希(xi)(xi)望(wang)(wang)(wang)帶(dai)(dai)(dai)(dai)Cl-則(ze)用HCl，希(xi)(xi)望(wang)(wang)(wang)帶(dai)(dai)(dai)(dai)OH-則(ze)用NaOH。用過(guo)的樹脂(zhi)(zhi)使其恢(hui)復原(yuan)狀的方(fang)法稱為(wei)再生。并(bing)非每次再一都用酸、鹼液洗(xi)滌，往往只要(yao)轉型處理就行了。
（二）柱上操作(zuo)
⑴交(jiao)換劑(ji)裝柱zui簡單的(de)(de)交(jiao)換層析柱可用鹼式滴定管(guan)(guan)代替。處理過的(de)(de)樹脂放入燒(shao)杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持(chi)垂直的(de)(de)層析管(guan)(guan)中(zhong)，使樹脂緩慢(man)沉降。交(jiao)換劑(ji)在柱內必須分布(bu)均(jun)勻。
⑵上樣(yang)向(xiang)層(ceng)析柱(zhu)內(nei)傾入樣(yang)品液
⑶洗脫與(yu)收集(ji)
不(bu)同樣品選(xuan)(xuan)用(yong)(yong)的(de)洗脫液不(bu)同。原(yuan)則是用(yong)(yong)一(yi)(yi)種比吸(xi)著(zhu)(zhu)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)更(geng)活潑的(de)離子(zi)，把吸(xi)著(zhu)(zhu)物(wu)(wu)(wu)交換出來。由(you)于被吸(xi)著(zhu)(zhu)的(de)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)往往不(bu)是我們所要求的(de)單一(yi)(yi)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)，因此除(chu)了(le)正確選(xuan)(xuan)擇洗脫液外還采(cai)控制流速和分布收集的(de)方法來獲(huo)得所需的(de)單一(yi)(yi)物(wu)(wu)(wu)質(zhi)。
膠色譜法
凝膠色譜技術是(shi)六十年代初發展起來的一種快速而又簡(jian)單(dan)(dan)的分(fen)(fen)離分(fen)(fen)技術，由于設(she)備簡(jian)單(dan)(dan)、操作方便，不需(xu)要有機溶劑(ji)，對高(gao)分(fen)(fen)子物(wu)質有很高(gao)的分(fen)(fen)離效果。目前已(yi)經被生(sheng)(sheng)物(wu)化(hua)學(xue)、分(fen)(fen)子生(sheng)(sheng)物(wu)學(xue)、生(sheng)(sheng)物(wu)工程學(xue)、分(fen)(fen)子免疫學(xue)以(yi)及醫學(xue)等有關領(ling)域廣泛(fan)采用，不但應(ying)用于科學(xue)實(shi)驗研究，而且已(yi)經大規模(mo)地(di)用于工業生(sheng)(sheng)產。
一、基本理論
（一）分子篩效(xiao)益
一(yi)個含有(you)(you)(you)(you)各(ge)(ge)種(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)樣(yang)品溶液(ye)緩慢地流經凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)色(se)譜(pu)柱(zhu)時(shi)，各(ge)(ge)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)在(zai)(zai)柱(zhu)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)同(tong)時(shi)進(jin)(jin)(jin)(jin)行著兩(liang)(liang)(liang)種(zhong)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)運(yun)動(dong)：垂直(zhi)向下(xia)(xia)(xia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)移(yi)動(dong)和(he)無(wu)定向的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)擴散(san)運(yun)動(dong)。大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)物(wu)質由(you)于直(zhi)徑(jing)(jing)較(jiao)(jiao)(jiao)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)，不(bu)易進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)顆(ke)粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)，而(er)只能(neng)(neng)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)顆(ke)粒(li)(li)之(zhi)間(jian)(jian)，所(suo)以在(zai)(zai)洗脫時(shi)向下(xia)(xia)(xia)移(yi)動(dong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)速度較(jiao)(jiao)(jiao)快。小(xiao)(xiao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)物(wu)質除了可(ke)在(zai)(zai)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)顆(ke)粒(li)(li)間(jian)(jian)隙(xi)(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)擴散(san)外(wai)(wai)，還可(ke)以進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)顆(ke)粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)中(zhong)(zhong)(zhong)，即進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)相(xiang)(xiang)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)，在(zai)(zai)向下(xia)(xia)(xia)移(yi)動(dong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)過程(cheng)中(zhong)(zhong)(zhong)，從一(yi)個凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)擴散(san)到顆(ke)粒(li)(li)間(jian)(jian)隙(xi)(xi)后再進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)另(ling)一(yi)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)顆(ke)粒(li)(li)，如(ru)此不(bu)斷地進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)和(he)擴散(san)，小(xiao)(xiao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)物(wu)質的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)下(xia)(xia)(xia)移(yi)速度落后于大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)物(wu)質，從而(er)使(shi)樣(yang)品中(zhong)(zhong)(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)先流出(chu)色(se)譜(pu)柱(zhu)，中(zhong)(zhong)(zhong)等分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)后流出(chu)，分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)zui小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)zui后流出(chu)，這(zhe)種(zhong)現(xian)象叫分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)篩(shai)(shai)效應。具有(you)(you)(you)(you)多(duo)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)就(jiu)是(shi)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)篩(shai)(shai)。各(ge)(ge)種(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)篩(shai)(shai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)有(you)(you)(you)(you)一(yi)定范圍，有(you)(you)(you)(you)zui大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)極(ji)限和(he)zui小(xiao)(xiao)極(ji)限。分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)直(zhi)徑(jing)(jing)比凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)zui大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)直(zhi)徑(jing)(jing)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)，就(jiu)會全部(bu)被排(pai)阻(zu)在(zai)(zai)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)顆(ke)粒(li)(li)之(zhi)外(wai)(wai)，這(zhe)種(zhong)情(qing)(qing)(qing)況叫全排(pai)阻(zu)。兩(liang)(liang)(liang)種(zhong)全排(pai)阻(zu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)即使(shi)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)不(bu)同(tong)，也不(bu)能(neng)(neng)有(you)(you)(you)(you)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)效果。直(zhi)徑(jing)(jing)比凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)zui小(xiao)(xiao)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)直(zhi)徑(jing)(jing)小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)能(neng)(neng)進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)全部(bu)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)。如(ru)果兩(liang)(liang)(liang)種(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)都能(neng)(neng)全部(bu)進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)，即使(shi)它們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)有(you)(you)(you)(you)差別(bie)，也不(bu)會有(you)(you)(you)(you)好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)效果。因此，一(yi)定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)篩(shai)(shai)有(you)(you)(you)(you)它一(yi)定的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)使(shi)用范圍。綜上(shang)所(suo)述，在(zai)(zai)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)色(se)譜(pu)中(zhong)(zhong)(zhong)會有(you)(you)(you)(you)三種(zhong)情(qing)(qing)(qing)況，一(yi)是(shi)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)很小(xiao)(xiao)，能(neng)(neng)進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)篩(shai)(shai)全部(bu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)；二是(shi)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)很大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)，*不(bu)能(neng)(neng)進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)任何內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)；三是(shi)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)適中(zhong)(zhong)(zhong)，能(neng)(neng)進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)徑(jing)(jing)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)相(xiang)(xiang)應的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)部(bu)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)。大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)、中(zhong)(zhong)(zhong)、小(xiao)(xiao)三類(lei)(lei)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)彼此間(jian)(jian)較(jiao)(jiao)(jiao)易分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)開，但(dan)每種(zhong)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)范圍之(zhi)外(wai)(wai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)，在(zai)(zai)不(bu)改變凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)種(zhong)類(lei)(lei)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)情(qing)(qing)(qing)況下(xia)(xia)(xia)是(shi)很難分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。對(dui)于分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)不(bu)同(tong)，但(dan)同(tong)屬于凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)范圍內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)各(ge)(ge)種(zhong)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)，在(zai)(zai)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)床(chuang)(chuang)(chuang)中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)布(bu)(bu)情(qing)(qing)(qing)況是(shi)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)：分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)較(jiao)(jiao)(jiao)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)只能(neng)(neng)進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)徑(jing)(jing)較(jiao)(jiao)(jiao)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)那一(yi)部(bu)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)，而(er)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)可(ke)進(jin)(jin)(jin)(jin)入(ru)(ru)較(jiao)(jiao)(jiao)多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)顆(ke)粒(li)(li)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)，這(zhe)樣(yang)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)較(jiao)(jiao)(jiao)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)在(zai)(zai)凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)床(chuang)(chuang)(chuang)內(nei)(nei)(nei)(nei)(nei)移(yi)動(dong)距離(li)(li)(li)較(jiao)(jiao)(jiao)短，分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)較(jiao)(jiao)(jiao)小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)移(yi)動(dong)距離(li)(li)(li)較(jiao)(jiao)(jiao)長。于是(shi)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)較(jiao)(jiao)(jiao)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)先通過凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)床(chuang)(chuang)(chuang)而(er)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)較(jiao)(jiao)(jiao)小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)后通過凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)床(chuang)(chuang)(chuang)，這(zhe)樣(yang)就(jiu)利用分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)篩(shai)(shai)可(ke)將分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)量(liang)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)物(wu)質分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)(li)(li)。另(ling)外(wai)(wai)，凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)本(ben)身具有(you)(you)(you)(you)三維網(wang)狀結構，大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)在(zai)(zai)通過這(zhe)種(zhong)網(wang)狀結構上(shang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)孔(kong)(kong)(kong)(kong)(kong)隙(xi)(xi)時(shi)阻(zu)力(li)較(jiao)(jiao)(jiao)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)，小(xiao)(xiao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)通過時(shi)阻(zu)力(li)較(jiao)(jiao)(jiao)小(xiao)(xiao)。分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)量(liang)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)不(bu)同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)多(duo)種(zhong)成份在(zai)(zai)通過凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)床(chuang)(chuang)(chuang)時(shi)，按照(zhao)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)量(liang)大(da)(da)(da)(da)(da)(da)(da)小(xiao)(xiao)“排(pai)隊，凝(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)(jiao)表現(xian)分(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)(fen)子(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)(zi)篩(shai)(shai)效應。
（二）色譜柱的重要參數
⑴柱(zhu)體(ti)積(ji)(ji)：柱(zhu)體(ti)積(ji)(ji)是指凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)裝柱(zhu)后，從(cong)柱(zhu)的底板到凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)沉積(ji)(ji)表面的體(ti)積(ji)(ji)。在色(se)譜柱(zhu)中(zhong)充滿凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)的部分稱為凝(ning)(ning)膠(jiao)(jiao)床，因引柱(zhu)體(ti)積(ji)(ji)又稱“床”體(ti)積(ji)(ji)，常用Vt
表示。
⑵外(wai)水(shui)(shui)體(ti)(ti)積(ji)(ji)：色譜柱內凝膠顆粒間隙，這部分體(ti)(ti)積(ji)(ji)稱(cheng)外(wai)水(shui)(shui)體(ti)(ti)積(ji)(ji)，亦(yi)稱(cheng)間隙體(ti)(ti)積(ji)(ji)，常用Vo表示。
⑶內(nei)水體(ti)(ti)積：因為(wei)凝膠(jiao)為(wei)三維(wei)網狀結(jie)構(gou)，顆(ke)粒(li)內(nei)部仍有空間，液體(ti)(ti)可進入顆(ke)粒(li)內(nei)部，這(zhe)就分間隙的總(zong)和(he)為(wei)內(nei)水體(ti)(ti)積，又(you)稱(cheng)定相體(ti)(ti)積，常用Vi表(biao)示。
不包括(kuo)固體支持物的(de)體積（Vg）。
⑷峰洗脫體(ti)(ti)積：是(shi)指被分離(li)物質通過(guo)凝膠柱所需洗脫液有體(ti)(ti)積，常(chang)用(yong)Ve
表示。當使用樣品的體(ti)(ti)積很(hen)少時，（與洗(xi)(xi)脫(tuo)體(ti)(ti)積比較(jiao)可以忽(hu)略不(bu)計），在洗(xi)(xi)脫(tuo)圖(tu)中，從加(jia)樣到峰頂位置所用洗(xi)(xi)脫(tuo)液體(ti)(ti)積為Ve。
當樣品體(ti)積(ji)與洗脫體(ti)積(ji)比(bi)較不能(neng)忽略(lve)時(shi)，洗脫體(ti)積(ji)計算可(ke)以(yi)從(cong)樣品體(ti)積(ji)的一半到峰頂(ding)位(wei)置。當樣品很大(da)時(shi)，洗脫體(ti)積(ji)計算可(ke)以(yi)從(cong)應用樣品開(kai)始(shi)到洗脫峰升高(gao)的彎曲點（或半高(gao)處）。
二、凝膠的種類及(ji)性質
（一）交聯(lian)葡聚糖凝膠(jiao)（Sephadex）
⑴Sephadex
G交聯(lian)(lian)葡(pu)聚糖的(de)商品名為(wei)Sephndex，不同(tong)規格型(xing)號(hao)的(de)葡(pu)聚糖用英文字母G表(biao)示，G后面的(de)阿拉伯數為(wei)凝(ning)膠得(de)水值的(de)10倍(bei)。例如，G-25為(wei)每克(ke)凝(ning)膠膨脹時吸水2.5克(ke)，同(tong)樣(yang)G-200克(ke)每克(ke)千膠吸水20克(ke)。交聯(lian)(lian)葡(pu)聚糖凝(ning)膠的(de)種(zhong)類有(you)G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和(he)G-200。因此，“G”反映，凝(ning)膠的(de)交聯(lian)(lian)程(cheng)度(du)，膨脹程(cheng)度(du)及分(fen)部范圍。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的(de)羧丙基(ji)衍生物(wu)(wu)， 能溶于水及親脂溶劑，用于分離(li)不溶于水的(de)物(wu)(wu)質(zhi)。
（二）瓊脂糖凝膠：
商品名很多，常見的有(you)，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美(mei)國Bio-Rad）等。瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠(jiao)是依(yi)靠糖鏈(lian)(lian)之間的次級鏈(lian)(lian)如氫鍵來維(wei)持網狀(zhuang)結構，網狀(zhuang)結構的疏密依(yi)靠瓊(qiong)脂(zhi)糖的濃(nong)度。一般情況下，它(ta)的結構是穩定的，可以在許多條(tiao)件下使(shi)用（如水，pH4-9范圍內的鹽溶液(ye)）。瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠(jiao)在40℃以上開始融化(hua)(hua)，也(ye)不能高壓消(xiao)毒，可用化(hua)(hua)學(xue)滅菌活(huo)處理(li)。
（三）聚丙(bing)烯酰胺凝膠(jiao)：
是一種人(ren)工合成(cheng)凝膠，是以(yi)丙(bing)烯酰胺為(wei)單位，
由甲(jia)叉雙丙烯(xi)酰胺(an)交聯成(cheng)的(de)，經干燥粉碎或加工成(cheng)形制(zhi)成(cheng)粒狀，控制(zhi)交聯劑(ji)的(de)用量(liang)可(ke)制(zhi)成(cheng)各(ge)種型號(hao)的(de)凝膠。交聯劑(ji)越(yue)多，孔隙越(yue)小。聚丙烯(xi)酰胺(an)凝膠的(de)商品為生物膠－P
（Bio-Gel P），由美(mei)國Bio-Rod廠(chang)生產，型號(hao)很多，從(cong)P-2至P-300共10種(zhong)，P
后面的數字再(zai)乘1000就相當(dang)于該凝膠的排阻限度。
（四）聚(ju)苯乙烯凝膠商(shang)品(pin)為Styrogel ， 具有大網孔(kong)結構，
可用(yong)(yong)于分(fen)離分(fen)子量1600到(dao)40，000，000的生物(wu)大(da)分(fen)子，適用(yong)(yong)于有機多聚物(wu)，分(fen)子量測定和脂溶性(xing)天然物(wu)的分(fen)級，凝膠機械強度好，洗脫劑可用(yong)(yong)甲(jia)基亞砜(feng)。
三、實驗技術
（一）層析柱
層析柱(zhu)是凝(ning)(ning)膠(jiao)層析技(ji)術(shu)中(zhong)的主體(ti)，一(yi)般用(yong)(yong)玻璃管(guan)或(huo)有(you)機玻璃管(guan)。層析柱(zhu)的直徑大小(xiao)不影響分(fen)離度，樣品用(yong)(yong)量大，可加(jia)大柱(zhu)的直徑，一(yi)般制備用(yong)(yong)凝(ning)(ning)膠(jiao)柱(zhu)，直徑大于2厘(li)米，但在加(jia)樣時應將樣品均勻分(fen)布于凝(ning)(ning)膠(jiao)柱(zhu)床面上。此(ci)外，
直徑加大(da)，洗脫液體體積增(zeng)大(da)，樣(yang)品(pin)(pin)稀釋度(du)大(da)。分(fen)離度(du)取決于柱高，為(wei)分(fen)離不(bu)同組(zu)分(fen)，凝(ning)膠(jiao)柱床必須有適宜的高度(du)，分(fen)離度(du)與(yu)柱高的平(ping)方根相關，但由(you)于軟(ruan)凝(ning)膠(jiao)柱過高擠(ji)壓變形(xing)阻塞，一(yi)般(ban)(ban)不(bu)超(chao)過1米(mi)。分(fen)族分(fen)離時用短柱，一(yi)般(ban)(ban)凝(ning)膠(jiao)柱長20-30厘米(mi)，柱高與(yu)直徑的比較5:1─10:1，凝(ning)膠(jiao)床體積為(wei)樣(yang)品(pin)(pin)溶液體積的4-10倍。
分(fen)級分(fen)離時(shi)(shi)柱(zhu)高(gao)與直徑(jing)之(zhi)線(xian)為20:1─100:1，常用(yong)凝膠柱(zhu)有50×25厘(li)米(mi)，10×25厘(li)米(mi)。層(ceng)析柱(zhu)濾板(ban)(ban)下的死體(ti)積(ji)(ji)(ji)應盡可(ke)能(neng)(neng)的小，如果支掌(zhang)濾板(ban)(ban)下的死體(ti)積(ji)(ji)(ji)大，被分(fen)離組分(fen)之(zhi)間重新混合的可(ke)能(neng)(neng)性就(jiu)大，其結(jie)果是影響洗脫峰形，出現拖尾出象，降低(di)分(fen)辯(bian)力。在分(fen)離時(shi)(shi)，死體(ti)積(ji)(ji)(ji)不能(neng)(neng)超過總床體(ti)積(ji)(ji)(ji)的1/1000。
（二(er)）凝(ning)膠的(de)選擇 根(gen)據所需凝(ning)膠體(ti)積，估(gu)計所需干(gan)膠的(de)量。 一般葡聚糖凝(ning)膠吸水后的(de)凝(ning)膠體(ti)積約為其吸水量的(de)2倍，例如Sephadex
G-20的吸水量為20，1 克Sephadex
G─200吸水后形成的(de)凝(ning)(ning)膠(jiao)體(ti)積約(yue)40ml。凝(ning)(ning)膠(jiao)的(de)粒(li)(li)度也可影響層析分(fen)離效(xiao)果。粒(li)(li)度細胞分(fen)離效(xiao)果好，但阻(zu)力大，流(liu)速慢。一般(ban)實驗室分(fen)離蛋白質采(cai)用100-200號篩目的(de)的(de)Sephadex
; G-200效果好， 脫鹽(yan)用(yong)Sephadex G-25、G-50，用(yong)粗粒(li)，短柱，流速快。
（三）凝(ning)膠(jiao)的制備
商品凝(ning)膠是干燥的顆粒使用(yong)(yong)前(qian)需直接在(zai)(zai)欲使用(yong)(yong)的洗脫液中(zhong)膨脹(zhang)。為了加(jia)速(su)膨脹(zhang)，可用(yong)(yong)加(jia)熱法，即在(zai)(zai)沸水浴(yu)中(zhong)將濕凝(ning)膠逐(zhu)漸升(sheng)溫至近沸，這樣(yang)可大大中(zhong)速(su)膨脹(zhang)，通(tong)常在(zai)(zai)1-2小時內即可完成。特別是在(zai)(zai)使用(yong)(yong)軟膠時，
自然膨脹(zhang)需(xu)24小時至數(shu)天(tian)，而(er)用加熱法(fa)(fa)在(zai)幾(ji)小時內就可(ke)完成。這種方法(fa)(fa)不但節約時間，而(er)且還可(ke)消毒，除去凝膠(jiao)中污染的(de)細(xi)菌和排除膠(jiao)內的(de)空(kong)氣。
（四）樣(yang)品溶液的處理 樣(yang)品溶液如有沉(chen)淀應過濾或(huo)離心(xin)除去，如含脂類(lei)可高速離心(xin)或(huo)通(tong)過Sephadex
G-15短柱除去。樣品(pin)的(de)粘(zhan)度不可大(da)，含蛋(dan)(dan)白為超過4％，粘(zhan)度高影響分(fen)(fen)離效果。上(shang)柱樣品(pin)液的(de)體(ti)(ti)積根據凝(ning)(ning)膠床(chuang)體(ti)(ti)積的(de)分(fen)(fen)離要求確定。分(fen)(fen)離蛋(dan)(dan)白質樣品(pin)的(de)體(ti)(ti)積為凝(ning)(ning)膠床(chuang)的(de)1-4％（一般約0.5-2ml），進行分(fen)(fen)族分(fen)(fen)離時樣品(pin)液可為凝(ning)(ning)膠床(chuang)的(de)10％，在(zai)蛋(dan)(dan)白質溶液除鹽(yan)時，樣品(pin)可達(da)凝(ning)(ning)膠床(chuang)的(de)20-30％。
分級分離(li)樣品(pin)體積要小，使樣品(pin)層盡可能窄，洗脫出的峰形(xing)較好。
; （五）防止微生(sheng)物(wu)的污染 交聯(lian)葡(pu)聚糖和瓊脂糖都是多糖類(lei)物(wu)質(zhi)，防止微生(sheng)物(wu)的生(sheng)長(chang)，在凝膠(jiao)層(ceng)析中十分重要，常用(yong)的抑(yi)菌劑有:
⑴疊(die)(die)氨(an)鈉(na)（NaN3）在(zai)凝膠(jiao)層(ceng)析中只要用0.02％疊(die)(die)氮鈉(na)已足夠防止(zhi)微生(sheng)物(wu)的生(sheng)長(chang)，疊(die)(die)氮鈉(na)易(yi)溶一水，在(zai)20℃時約為40％；它不(bu)與(yu)蛋白質(zhi)或碳水化(hua)合物(wu)相(xiang)互作(zuo)用，因此(ci)疊(die)(die)氮鈉(na)不(bu)影響抗體(ti)活力；不(bu)會改(gai)變蛋白質(zhi)和碳水化(hua)合物(wu)的層(ceng)析我特性(xing)。疊(die)(die)氮鈉(na)可干擾熒光標記蛋白質(zhi)。
⑵可樂(le)酮(tong)[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝膠層(ceng)析(xi)中使用濃度為0.01-0.02％。在微(wei)酸性溶(rong)液(ye)中它的殺菌(jun)效果*，在強堿性溶(rong)液(ye)中或溫度高于(yu)60℃時易引起分解(jie)而失效。
⑶乙(yi)基(ji)汞代(dai)巰基(ji)水(shui)楊酸鈉 在(zai)凝膠(jiao)層析中(zhong)作為(wei)抑菌(jun)(jun)劑使用濃度(du)(du)為(wei)0.05-0. 01％。在(zai)微酸性溶液(ye)中(zhong)zui為(wei)有效。重金(jin)屬(shu)離(li)子可(ke)使乙(yi)基(ji)代(dai)巰基(ji)的物質結合，因而包含疏基(ji)的蛋白(bai)質可(ke)在(zai)不同程度(du)(du)上降低它的抑菌(jun)(jun)效果(guo)。
⑷苯基汞(gong)代鹽(yan)
在凝膠(jiao)層析(xi)中使(shi)用濃度為0.001-0.01％。在微堿性溶液中抑(yi)效(xiao)果*，長(chang)時間放置時可與鹵(lu)素、硝(xiao)酸根離子作用而(er)產(chan)生(sheng)沉淀(dian)；還原劑(ji)可引起此化合物分(fen)解；含疏基的(de)物質亦可降低或抑(yi)制它的(de)抑(yi)菌作用。
親和色譜(pu)法
一、基本理論
（一）原理
在(zai)生物(wu)體(ti)內，許多大(da)分(fen)子AKSJDHFKLSDFHKLSDJ具有(you)與(yu)某些相對應的(de)(de)專一分(fen)子可(ke)逆結合(he)的(de)(de)特性(xing)。例如(ru)抗(kang)原(yuan)和(he)(he)(he)抗(kang)體(ti)、酶和(he)(he)(he)底物(wu)及輔酶、激素和(he)(he)(he)受體(ti)、RNA和(he)(he)(he)其(qi)互補的(de)(de)DNA等，都(dou)具有(you)這種特性(xing)。生物(wu)分(fen)子之間這種特異的(de)(de)結合(he)能力稱(cheng)(cheng)為(wei)親(qin)(qin)和(he)(he)(he)力，根據生物(wu)分(fen)子間親(qin)(qin)和(he)(he)(he)吸附和(he)(he)(he)解(jie)離的(de)(de)原(yuan)理，建立起來的(de)(de)色譜法稱(cheng)(cheng)親(qin)(qin)色譜法。親(qin)(qin)和(he)(he)(he)色譜中兩個(ge)進行專一結合(he)的(de)(de)分(fen)子互稱(cheng)(cheng)對方(fang)為(wei)配(pei)(pei)基(ji)(ji)(ji)。如(ru)抗(kang)原(yuan)和(he)(he)(he)抗(kang)體(ti)，抗(kang)原(yuan)可(ke)認為(wei)是(shi)抗(kang)體(ti)的(de)(de)配(pei)(pei)基(ji)(ji)(ji)，反之抗(kang)體(ti)也可(ke)認為(wei)是(shi)抗(kang)原(yuan)的(de)(de)配(pei)(pei)基(ji)(ji)(ji)。將一個(ge)水溶性(xing)配(pei)(pei)基(ji)(ji)(ji)在(zai)不(bu)傷害其(qi)生物(wu)學功(gong)能的(de)(de)情況下與(yu)水不(bu)溶性(xing)載(zai)體(ti)結合(he)稱(cheng)(cheng)為(wei)配(pei)(pei)基(ji)(ji)(ji)的(de)(de)固(gu)相化。親(qin)(qin)和(he)(he)(he)色譜法的(de)(de)基(ji)(ji)(ji)本過(guo)程是(shi)：
1.配基固相化。將與(yu)純化對象有專一結合作用的物(wu)質，連(lian)接(jie)在水(shui)不溶性載體(ti)上(shang)，制成親(qin)(qin)和吸附劑后裝柱（稱親(qin)(qin)和性）。
2.親(qin)和(he)(he)吸(xi)附。將含(han)有純化對象的混合物通過親(qin)和(he)(he)柱，純化對象吸(xi)附在(zai)柱上，其他物質(zhi)流(liu)出(chu)色譜(pu)柱。
3.解吸(xi)附。用某(mou)種緩沖液(ye)或溶(rong)液(ye)通過親和柱，把吸(xi)附在(zai)親和柱上的欲(yu)純化物質洗脫出來。
（二）應用(yong)范圍
親和色譜可用(yong)于下列生(sheng)物體(ti)系：
酶(mei)：底物、抑制劑、輔酶(mei)
抗體：抗原、病(bing)毒、細胞
; 外源凝集素：多糖、糖蛋白、細胞表(biao)面受體、
細胞核(he)(he)酸：互補堿基序列、組蛋白(bai)、核(he)(he)酸聚合(he)酶(mei) 、結(jie)合(he)蛋白(bai)
激素及維生素：受體、載(zai)體蛋(dan)白
細(xi)胞：細(xi)胞表(biao)面特異蛋白、外源(yuan)凝(ning)集(ji)素
親和色(se)譜的(de)優(you)點是(shi)操作簡便、效率高、條件溫(wen)和，缺點是(shi)使用局限性大。
（三）載體(ti)的選擇原則
用于親(qin)和色譜的(de)理(li)想(xiang)載體應具有(you)(you)下列特性：⑴不(bu)溶性：不(bu)溶于水；⑵滲透性：疏松(song)網狀(zhuang)(zhuang)結(jie)構，容許大(da)分(fen)子自由(you)通過；⑶有(you)(you)一定(ding)硬度，為均一的(de)珠狀(zhuang)(zhuang)；⑷具有(you)(you)大(da)量可(ke)供反應的(de)化(hua)學(xue)基團，能(neng)(neng)與(yu)大(da)量配基共價連接；⑸非特異(yi)性吸附能(neng)(neng)力極(ji)低(di)；⑹能(neng)(neng)抗微生物和酶(mei)的(de)侵蝕(shi)；⑺有(you)(you)較好的(de)化(hua)學(xue)穩(wen)定(ding)性；⑻親(qin)水性。選擇(ze)配基根據對純化(hua)大(da)分(fen)子的(de)特異(yi)性的(de)全面認識。
選擇也(ye)的配基有兩條標(biao)準：
*是(shi)蛋白質和(he)配(pei)基之間必(bi)須有強的親和(he)力，解(jie)離常(chang)數在5mM以上不是(shi)好(hao)配(pei)基；
; 相反親(qin)和力太高也是有害的，因(yin)為在(zai)解(jie)離蛋白(bai)質──配基(ji)復(fu)合物(wu)(wu)時(shi)(shi)所需的條件就要(yao)強烈，這樣可能使蛋白(bai)質變(bian)性(xing)(xing)。例如用(yong)抗(kang)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)蛋白(bai)作配基(ji)純化(hua)含(han)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)的羧化(hua)酶時(shi)(shi)，生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)──抗(kang)生(sheng)物(wu)(wu)素(su)(su)(su)蛋白(bai)復(fu)合物(wu)(wu)的解(jie)離常數達10-15M，解(jie)離時(shi)(shi)需要(yao)pH1.5，6M鹽酸胍，在(zai)這種條件中。羧化(hua)酶大多(duo)數已經變(bian)性(xing)(xing)。
選擇配(pei)基(ji)的(de)第二(er)個標(biao)準(zhun)是，配(pei)基(ji)必須具有適當的(de)化(hua)學基(ji)團，這種基(ji)團不(bu)參與(yu)配(pei)基(ji)與(yu)蛋(dan)白(bai)質之間特異結合(he)，但可(ke)用于活化(hua)和(he)載體(ti)相連(lian)接(jie)，同時又不(bu)影響配(pei)基(ji)與(yu)蛋(dan)白(bai)質之間的(de)親(qin)和(he)力。
（四）常見載體的(de)特性(xing)
瓊脂糖凝膠： 親水性(xing)強，理(li)化性(xing)質(zhi)穩定 （商品名：Sepharose）
聚丙烯酰胺(an)凝膠： 理化性(xing)質(zhi)穩定，耐有機(ji)溶劑(ji)(ji)及去(qu)污劑(ji)(ji)， 抗微生物能力強， 特別適應用配基與提取物親和力比較弱(ruo)的物質(zhi)。
葡聚糖凝膠： 有(you)良好的化學及物理性質，孔(kong)經小。
纖(xian)維素： 非特易吸附嚴重，廉(lian)價，易得。
二、實驗方法
親和(he)色譜分離的(de)(de)方法隨每種分離物(wu)質(zhi)的(de)(de)不同而有(you)不同。一(yi)般推薦(jian)使用的(de)(de)程(cheng)序(xu)如下：
1選 擇(ze) 配(pei) 基；2選擇(ze)偶聯凝膠；3偶 聯 配(pei) 基；4裝填合適(shi)的柱；5平(ping)衡(heng)（2-3倍體(ti)積緩沖液）；6應(ying) 用 樣
品；7洗滌未結(jie)合物質；8洗脫結(jie)合物質→除鹽(yan)；9再生
高壓液(ye)相色譜
Martin 和(he)
Synge在1941年就提出相色(se)譜(pu)的設想，然而直到六十年代后期，由于(yu)各種(zhong)技(ji)術的發(fa)展，液相色(se)譜(pu)才付諸實(shi)現。這種(zhong)色(se)譜(pu)技(ji)術曾被(bei)稱為高速液相色(se)譜(pu)（HighSpeed
Liquid Chromatography），高壓液相(xiang)色譜(pu)（High Parss-ure Lipuid Chromatography），目前使用zui多的名稱是液相(xiang)色譜(pu)（High Pe-rformance Liauid
Chromatography，HPLC）。液(ye)相(xiang)(xiang)色譜(pu)(pu)已(yi)經(jing)廣泛地(di)應用(yong)，成為一項*的(de)技術。它(ta)的(de)主要優(you)點(dian)是⑴分(fen)(fen)(fen)辯(bian)率高(gao)于其它(ta)色譜(pu)(pu)法(fa)；⑵速度(du)(du)快，十幾(ji)分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)到幾(ji)十分(fen)(fen)(fen)鐘(zhong)可(ke)完成；⑶重復(fu)性高(gao)；⑷相(xiang)(xiang)色譜(pu)(pu)柱可(ke)反復(fu)使(shi)用(yong)；⑸自動化操作，分(fen)(fen)(fen)析度(du)(du)高(gao)。根(gen)據分(fen)(fen)(fen)離(li)過程中溶質(zhi)分(fen)(fen)(fen)子與固定相(xiang)(xiang)相(xiang)(xiang)互作用(yong)的(de)差別，液(ye)相(xiang)(xiang)色譜(pu)(pu)可(ke)分(fen)(fen)(fen)為四(si)個基本類型(xing)，即(ji)液(ye)－固色譜(pu)(pu)、液(ye)－液(ye)色譜(pu)(pu)、離(li)子交換(huan)色譜(pu)(pu)和體(ti)積排阻色譜(pu)(pu)。液(ye)相(xiang)(xiang)色譜(pu)(pu)在(zai)生(sheng)物領(ling)域中廣泛用(yong)于下列產物的(de)分(fen)(fen)(fen)離(li)和鑒定：⑴氨基酸及其衍生(sheng)物；⑵有機酸；⑶甾(zai)體(ti)化合物；⑷生(sheng)物鹼；⑸抗菌(jun)素；⑹糖類；⑺卟(bu)啉；⑻核酸及其降解產物；⑼蛋(dan)白質(zhi)、酶(mei)和多肽(tai)；⑽脂
一(yi)、分(fen)類(lei)
液(ye)相色(se)譜(pu)(pu)法(fa)(fa)可分為四(si)個基本類型：即液(ye)－固色(se)譜(pu)(pu)法(fa)(fa)，鍵合相色(se)譜(pu)(pu)法(fa)(fa)，離子交(jiao)換(huan)色(se)譜(pu)(pu)法(fa)(fa)及(ji)體積排(pai)阻色(se)譜(pu)(pu)法(fa)(fa)。
（一）液－固色(se)譜(pu)法
液－固(gu)色譜法(fa)通常稱吸(xi)附色譜法(fa)，吸(xi)附劑有活性(xing)(xing)碳(tan)，氧化(hua)鋁(lv)和硅(gui)膠(jiao)(jiao)(jiao)，在液－固(gu)色譜法(fa)中(zhong)用的載體(ti)都是硅(gui)膠(jiao)(jiao)(jiao)。硅(gui)膠(jiao)(jiao)(jiao)對溶質，分子(zi)的吸(xi)附能(neng)力不是平均(jun)分布(bu)在整個(ge)硅(gui)脫表(biao)(biao)面的，在硅(gui)膠(jiao)(jiao)(jiao)表(biao)(biao)面有一些區域與(yu)溶質分子(zi)強(qiang)烈相(xiang)(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用，這些區域為(wei)活性(xing)(xing)位置(zhi)，硅(gui)膠(jiao)(jiao)(jiao)與(yu)溶質分子(zi)間(jian)主要作(zuo)(zuo)用是偶極距力氫鍵及(ji)靜電(dian)相(xiang)(xiang)(xiang)互(hu)作(zuo)(zuo)用。極性(xing)(xing)越強(qiang)，而化(hua)合物在硅(gui)膠(jiao)(jiao)(jiao)柱上的滯留時間(jian)也長。在液－固(gu)色譜中(zhong)，依靠流動(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)溶劑分子(zi)與(yu)溶質分子(zi)競爭固(gu)定相(xiang)(xiang)(xiang)互(hu)活性(xing)(xing)位置(zhi)，
從而(er)(er)使溶(rong)(rong)質(zhi)從色譜柱上洗脫下來。與(yu)硅膠表面活性位置結合(he)力強(qiang)的(de)溶(rong)(rong)劑(ji)洗脫溶(rong)(rong)質(zhi)分(fen)子的(de)能(neng)力強(qiang)，因而(er)(er)稱(cheng)強(qiang)溶(rong)(rong)劑(ji)，反之為弱(ruo)溶(rong)(rong)劑(ji)。液(ye)─固(gu)色譜法的(de)特點是適于分(fen)離色譜幾何(he)異構(gou)體，可用于脂溶(rong)(rong)性化合(he)物(wu)質(zhi)如磷脂，甾體化合(he)物(wu)，脂溶(rong)(rong)性維生(sheng)素，前列腺素等。
（二）鍵合(he)相(xiang)色譜法
鍵合相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)是由液－液色(se)(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)即分(fen)配色(se)(se)(se)譜(pu)發展起(qi)來(lai)的(de)。鍵合相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)將固定(ding)相(xiang)(xiang)共價結合在載體顆粒上，克服了分(fen)配色(se)(se)(se)譜(pu)中由于(yu)固定(ding)相(xiang)(xiang)在流動中有(you)微量溶解，及流動相(xiang)(xiang)通(tong)過色(se)(se)(se)譜(pu)柱時的(de)機(ji)械沖擊，固定(ding)相(xiang)(xiang)不(bu)斷損失，色(se)(se)(se)譜(pu)柱的(de)性質逐(zhu)漸改變等缺點。鍵合相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)可(ke)分(fen)為正常(chang)相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)和反相(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)(fa)。
1.正常相(xiang)色譜法
在(zai)正(zheng)(zheng)常相色(se)譜(pu)(pu)法中共(gong)價結合(he)到載體(ti)上(shang)的基(ji)(ji)團都是(shi)極(ji)性(xing)基(ji)(ji)團，如一級氨(an)(an)基(ji)(ji)、氰(qing)基(ji)(ji)、二(er)醇基(ji)(ji)、二(er)甲氨(an)(an)基(ji)(ji)和二(er)氨(an)(an)基(ji)(ji)等。流動(dong)相溶劑(ji)是(shi)與(yu)吸(xi)附色(se)譜(pu)(pu)中的流動(dong)相很相似的非(fei)極(ji)性(xing)溶劑(ji)，如庚烷、已烷及(ji)異辛烷等。由于固(gu)(gu)(gu)定相是(shi)極(ji)性(xing)，因此流動(dong)溶劑(ji)的極(ji)性(xing)越強(qiang)，洗(xi)脫能力(li)也越強(qiang)，即極(ji)性(xing)大的溶劑(ji)是(shi)強(qiang)溶劑(ji)。固(gu)(gu)(gu)定相與(yu)流動(dong)相的這(zhe)種關系正(zheng)(zheng)好與(yu)液－固(gu)(gu)(gu)色(se)譜(pu)(pu)法相同(tong)，稱這(zhe)種色(se)譜(pu)(pu)法為正(zheng)(zheng)常相色(se)譜(pu)(pu)法。盡(jin)管如此，正(zheng)(zheng)常相色(se)譜(pu)(pu)法的分(fen)離原理主要(yao)根據化合(he)物在(zai)固(gu)(gu)(gu)定相及(ji)流動(dong)相中分(fen)配系數的不同(tong)進行分(fen)離，它(ta)不適于分(fen)離幾何異構體(ti)。
2.反相色譜法
在(zai)反相(xiang)(xiang)色(se)譜法中共價結合(he)(he)到載體(ti)上(shang)的(de)固定(ding)相(xiang)(xiang)是(shi)一些直鏈(lian)碳氫化合(he)(he)物，如正辛基等。流動相(xiang)(xiang)的(de)極性比固定(ding)相(xiang)(xiang)的(de)極性強。反相(xiang)(xiang)色(se)譜法在(zai)液(ye)相(xiang)(xiang)色(se)譜法中應(ying)用zui廣泛。
在(zai)反相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜法中，使溶(rong)(rong)(rong)質滯(zhi)留的(de)主要(yao)作(zuo)用(yong)(yong)是(shi)疏水(shui)(shui)(shui)作(zuo)用(yong)(yong)，在(zai)液相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)譜中又被稱為疏溶(rong)(rong)(rong)劑作(zuo)用(yong)(yong)。所(suo)謂疏水(shui)(shui)(shui)作(zuo)用(yong)(yong)即當水(shui)(shui)(shui)中存在(zai)非極(ji)性溶(rong)(rong)(rong)質時，溶(rong)(rong)(rong)質分子之間(jian)的(de)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong) 、溶(rong)(rong)(rong)質分子與水(shui)(shui)(shui)分子之間(jian)的(de)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)遠小于水(shui)(shui)(shui)分子之間(jian)的(de)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)互作(zuo)用(yong)(yong)，
因(yin)此溶(rong)(rong)質(zhi)分(fen)子(zi)從(cong)(cong)水(shui)(shui)(shui)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)被“擠”了出去(qu)。可(ke)見反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)疏水(shui)(shui)(shui)性(xing)越強的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)合(he)(he)物(wu)越容易(yi)從(cong)(cong)流(liu)(liu)動(dong)(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)擠出去(qu)，在(zai)色(se)譜(pu)(pu)柱(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)滯留(liu)時間(jian)也長(chang)，所以反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法(fa)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)不同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)合(he)(he)物(wu)根(gen)據它們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)疏水(shui)(shui)(shui)特(te)性(xing)得(de)到(dao)(dao)分(fen)離(li)(li)。反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法(fa)適于(yu)(yu)分(fen)離(li)(li)帶有(you)不同(tong)疏水(shui)(shui)(shui)基(ji)(ji)(ji)團的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)合(he)(he)物(wu)，亦即非(fei)極性(xing)基(ji)(ji)(ji)團的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)合(he)(he)物(wu)。此外(wai)，反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法(fa)可(ke)用(yong)于(yu)(yu)分(fen)離(li)(li)帶有(you)不同(tong)極性(xing)基(ji)(ji)(ji)團的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)化(hua)合(he)(he)物(wu)。可(ke)以通過(guo)改變流(liu)(liu)動(dong)(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)劑(ji)及其(qi)(qi)組成和(he)(he)pH，以影響溶(rong)(rong)質(zhi)分(fen)子(zi)與(yu)流(liu)(liu)動(dong)(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)互作用(yong)，改變它們的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)滯留(liu)行為。另外(wai)，反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)水(shui)(shui)(shui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)(liu)動(dong)(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)占的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)比(bi)例伸縮性(xing)很大，可(ke)以／從(cong)(cong)0-100％，從(cong)(cong)而(er)(er)使反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)可(ke)用(yong)于(yu)(yu)水(shui)(shui)(shui)溶(rong)(rong)性(xing)、脂(zhi)溶(rong)(rong)性(xing)化(hua)合(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)離(li)(li)。反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法(fa)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)固定(ding)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)是(shi)(shi)(shi)被共價結(jie)合(he)(he)到(dao)(dao)硅膠載體(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)直鏈(lian)飽和(he)(he)和(he)(he)烷(wan)烴(jing)，其(qi)(qi)鏈(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)長(chang)短不同(tong)，zui長(chang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)是(shi)(shi)(shi)十八烷(wan)基(ji)(ji)(ji)，這也是(shi)(shi)(shi)使用(yong)得(de)zui多的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)固定(ding)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)。直鏈(lian)飽和(he)(he)烷(wan)烴(jing)疏水(shui)(shui)(shui)特(te)性(xing)隨著碳(tan)(tan)氫(qing)鏈(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)而(er)(er)增(zeng)加，在(zai)反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)柱(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)溶(rong)(rong)質(zhi)由于(yu)(yu)疏水(shui)(shui)(shui)作用(yong)而(er)(er)滯留(liu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)時間(jian)也將(jiang)隨著碳(tan)(tan)氫(qing)鏈(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)長(chang)度(du)而(er)(er)增(zeng)加。在(zai)一般情(qing)況下(xia)這意味著用(yong)碳(tan)(tan)氫(qing)鏈(lian)長(chang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)柱(zhu)能得(de)到(dao)(dao)較好的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)分(fen)辯率(lv)，在(zai)多數情(qing)況下(xia)是(shi)(shi)(shi)依靠反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)復來選擇色(se)譜(pu)(pu)柱(zhu)。由于(yu)(yu)反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)法(fa)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)固定(ding)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)是(shi)(shi)(shi)疏水(shui)(shui)(shui)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)碳(tan)(tan)氫(qing)化(hua)合(he)(he)物(wu)，溶(rong)(rong)質(zhi)與(yu)固定(ding)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)主(zhu)要是(shi)(shi)(shi)非(fei)極性(xing)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)互作用(yong)，或(huo)者(zhe)說疏水(shui)(shui)(shui)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)互作用(yong)，因(yin)此溶(rong)(rong)劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)強度(du)隨著極性(xing)降(jiang)低而(er)(er)增(zeng)加。水(shui)(shui)(shui)是(shi)(shi)(shi)極性(xing)zui強的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)劑(ji)，也是(shi)(shi)(shi)反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)zui弱的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)溶(rong)(rong)劑(ji)。在(zai)反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)常(chang)常(chang)用(yong)和(he)(he)基(ji)(ji)(ji)礎溶(rong)(rong)劑(ji)，向其(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)加入不同(tong)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)、可(ke)以與(yu)水(shui)(shui)(shui)混溶(rong)(rong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)有(you)機溶(rong)(rong)劑(ji)，以得(de)到(dao)(dao)不同(tong)強度(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)流(liu)(liu)動(dong)(dong)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)，這些有(you)機溶(rong)(rong)劑(ji)稱為修(xiu)(xiu)飾劑(ji)。反(fan)(fan)(fan)(fan)(fan)相(xiang)(xiang)(xiang)(xiang)色(se)譜(pu)(pu)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)zui常(chang)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)有(you)機溶(rong)(rong)劑(ji)有(you)甲醇和(he)(he)乙腈，此外(wai)，乙醇、四氫(qing)呋喃、異丙醇及二(er)氧六環也常(chang)被用(yong)作修(xiu)(xiu)飾劑(ji)。
在(zai)生化分(fen)(fen)析(xi)中(zhong)，反相色譜的(de)應用極廣。可用于①氨基酸(suan)和多肽的(de)分(fen)(fen)析(xi)；②蛋(dan)白(bai)質的(de)分(fen)(fen)離(li)(li)；③堿基，核酸(suan)和核酸(suan)酶的(de)分(fen)(fen)析(xi)；④甾體(ti)化合物的(de)分(fen)(fen)析(xi)；⑤以及其他如幾茶酚胺(an)(an)類，組胺(an)(an)，糖(tang)及維(wei)生素的(de)分(fen)(fen)離(li)(li)。
（三）離(li)子(zi)交(jiao)換色譜
離子交換色(se)譜中的(de)固定相是一(yi)些帶電荷的(de)基團，
這(zhe)些(xie)帶(dai)電(dian)(dian)基(ji)團通(tong)過靜電(dian)(dian)相(xiang)互作(zuo)用(yong)與帶(dai)相(xiang)反(fan)電(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)結(jie)合。如果(guo)流動相(xiang)中存在其(qi)(qi)他帶(dai)相(xiang)反(fan)電(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)，按(an)照質量作(zuo)用(yong)定律(lv)，這(zhe)些(xie)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)將(jiang)與結(jie)合在固定相(xiang)上的(de)(de)(de)反(fan)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)進行交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)。固定相(xiang)基(ji)團帶(dai)正(zheng)電(dian)(dian)荷(he)的(de)(de)(de)時候，其(qi)(qi)可(ke)(ke)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)為(wei)陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)，這(zhe)種(zhong)(zhong)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)為(wei)陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)；固定相(xiang)的(de)(de)(de)帶(dai)電(dian)(dian)基(ji)團帶(dai)負(fu)電(dian)(dian)荷(he)，可(ke)(ke)用(yong)來與流動相(xiang)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)的(de)(de)(de)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)就是(shi)陽離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)，這(zhe)種(zhong)(zhong)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)叫(jiao)做(zuo)陽離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)。陰離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)柱(zhu)的(de)(de)(de)功能團主(zhu)要是(shi)－NH2，及(ji)－MH3+：陽離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)的(de)(de)(de)功能團主(zhu)要是(shi)－SO3H及(ji)－COOH。其(qi)(qi)中-NH3+離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)柱(zhu)及(ji)-SO3H離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)屬于強(qiang)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)劑(ji)，它們在很廣泛的(de)(de)(de)pH范圍內都(dou)有(you)離(li)(li)(li)子(zi)(zi)(zi)(zi)交(jiao)(jiao)(jiao)換(huan)(huan)(huan)(huan)(huan)能力(li)；-NH2及(ji)-COOH
離(li)(li)子(zi)交(jiao)換(huan)柱屬于弱離(li)(li)子(zi)交(jiao)換(huan)劑，只有在一定(ding)的(de)(de)(de)pH值范圍內，才(cai)能(neng)有離(li)(li)子(zi)交(jiao)換(huan)能(neng)力。離(li)(li)子(zi)交(jiao)換(huan)色譜(pu)主要用于可電離(li)(li)化(hua)合物的(de)(de)(de)分離(li)(li)，例如，氨(an)基酸自(zi)動(dong)分析儀中的(de)(de)(de)色譜(pu)柱，多肽(tai)的(de)(de)(de)分離(li)(li)、蛋白質的(de)(de)(de)分離(li)(li)，核苷(gan)酸、核苷(gan)和各種堿基的(de)(de)(de)分離(li)(li)等。
二、易(yi)出現的問(wen)題
（一）渦(wo)流擴散（Eddy diffusion）
流(liu)動(dong)相碰(peng)到較(jiao)大的(de)(de)固(gu)體顆粒，就像流(liu)水碰(peng)到石頭一(yi)樣產生渦(wo)流(liu)。如(ru)果柱(zhu)裝(zhuang)填得不(bu)均(jun)勻，有(you)的(de)(de)部(bu)分松(song)散或(huo)有(you)細溝，則(ze)流(liu)動(dong)相的(de)(de)速度就快；有(you)的(de)(de)部(bu)位(wei)結(jie)塊或(huo)裝(zhuang)直緊(jin)密則(ze)流(liu)就慢，多條流(liu)路有(you)快有(you)慢，就使(shi)區帶變(bian)寬。因此，固(gu)相載體的(de)(de)顆粒要小而均(jun)勻，裝(zhuang)柱(zhu)要松(song)緊(jin)均(jun)一(yi)，這樣渦(wo)流(liu)擴散小，柱(zhu)效率(lv)高。
（二(er)）分子擴散（Molecular diffusion）
分(fen)子擴(kuo)(kuo)散(san)就(jiu)是物質(zhi)分(fen)子由濃(nong)度高的區(qu)域向濃(nong)度低(di)的區(qu)域運動，也稱縱向分(fen)子擴(kuo)(kuo)散(san)。要(yao)減(jian)少分(fen)子擴(kuo)(kuo)散(san)就(jiu)要(yao)采用(yong)小而均勻的固相顆粒裝柱。同時在操作時，如果流速太慢，被分(fen)離(li)物質(zhi)停留時間長(chang)，則擴(kuo)(kuo)散(san)嚴重。
（三）質量轉移(yi)（Mass transfer）
被分(fen)離物(wu)質要在流動(dong)相(xiang)與固定相(xiang)中平(ping)衡(heng)，這樣才能形成較窄的區帶(dai)。在液相(xiang)色(se)譜中，溶質分(fen)子要在兩(liang)個(ge)液相(xiang)之(zhi)間進(jin)行分(fen)配，或在固相(xiang)上被吸附(fu)和解吸附(fu)均需(xu)要一定的時間。當流速快時，轉(zhuan)移速度慢，來不及達(da)到平(ping)衡(heng)動(dong)相(xiang)就向前移，這各物(wu)質的非平(ping)衡(heng)移動(dong)，使(shi)區帶(dai)變寬。
（四）動(dong)相流速
當(dang)流(liu)速(su)(su)(su)太低時，分(fen)子擴散嚴重，特別是在(zai)氣相色(se)譜(pu)(pu)(pu)中尤為突出。如將理(li)論塔板(ban)高度(du)對流(liu)速(su)(su)(su)作圖，理(li)論塔板(ban)高度(du)隨(sui)流(liu)速(su)(su)(su)增加而急速(su)(su)(su)下(xia)降(jiang)，當(dang)達到(dao)zui低值時，流(liu)速(su)(su)(su)再加大(da)(da)則質(zhi)量轉移起主要作用，理(li)論塔板(ban)高度(du)又加大(da)(da)。在(zai)液相色(se)譜(pu)(pu)(pu)中，流(liu)速(su)(su)(su)稍快影(ying)響(xiang)(xiang)不(bu)大(da)(da)，但在(zai)凝(ning)膠過濾色(se)譜(pu)(pu)(pu)中，因為物質(zhi)要滲透到(dao)凝(ning)膠內部，所以質(zhi)量轉移影(ying)響(xiang)(xiang)大(da)(da)，流(liu)速(su)(su)(su)咖大(da)(da)會降(jiang)低柱效率。
（五）固定相顆粒(li)大小
定相(xiang)顆粒越(yue)小柱(zhu)效率越(yue)高，對(dui)流(liu)(liu)動(dong)(dong)相(xiang)流(liu)(liu)動(dong)(dong)的阻力越(yue)大，需要加大壓力才能(neng)使它流(liu)(liu)動(dong)(dong)。
