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1、 流動相
手性分析很關鍵的一項是流動相的選擇，手性分析一般都采用正相，使用zui多的流動相是正己烷、正庚烷、乙醇和異丙醇這四種，其中起洗脫作用的流動相是乙醇和異丙醇，正己烷和正庚烷用來調節流動相的洗脫強度。正己烷和正庚烷對于樣品分離沒有什么太大的影響，不會改變選擇性和分離度，通常都可以混用，不過正庚烷比正己烷對人體的傷害要小很多，但價格是后者的一倍，所以歐美的很多大制藥公司多使用正庚烷，而國內多使用正己烷。乙醇和異丙醇對樣品的分離起關鍵的作用，不同的醇有不同的選擇性，改變醇的種類可以改變選擇性，常用的醇類是乙醇和異丙醇，甲醇不能使用是因為它和正己烷、正庚烷不互溶，叔丁醇粘度太大，一般作為添加劑配合乙醇或者異丙醇少量使用，提供特殊的選擇性，通常能起到意想不到的效果。一般情況下分析手性樣品，很多人推薦異丙醇，因為乙醇氣味比異丙醇好一點，且乙醇做流動相壓力要低一些，實際上二者差別不是太大。
流動相里經常需要添加酸或者是堿來調節峰形，常用的酸有、乙酸和甲基磺酸，堿一般是二乙胺和三乙胺，也有用乙醇胺和異丁胺的，流動相里添加酸和堿的濃度一般要求控制在0.2%(體積比)以下，我們一般用0.1%，使用的原則一般是酸性樣品加酸，堿性樣品加堿，但實際上很多樣品是即含酸性基團又含堿性基團，這就要看哪個基團作用強了，對于某些含氨基的兩性樣品，例如苯甘氨酸，甲基磺酸是一個非常好的選擇，磺酸基能夠抑制氨基的堿性，又能提供一個酸性的流動相環境，使樣品既能得到很好的分離又能獲得對稱的峰形。
一般做純度分析檢測雜質含量時我們要求盡量的采用低波長來讓盡可能多的雜質有紫外吸收，而做手性分析時我們需要采用盡可能高的波長來去除在低波長下才有吸收的雜質的干擾，一般原則還是盡量選擇樣品紫外吸收的地方來獲得較高的靈敏度，但流動相里添加二乙胺會導致在低波長下基線波動變大，系統難以平衡，這種情況下一般要提高檢測波長，實際操作過程中有些樣品在高波長下吸收非常差，只能用低波長檢測，這樣的樣品可以嘗試在樣品稀釋的時候加入過量的二乙胺(但不宜太多)，而流動相用中性，從而獲得滿意的分析結果。有些樣品只添加堿或者酸效果不好，可以嘗試在樣品里同時添加酸或者堿，這種情況下通過酸堿同時加入，zui后獲得了非常漂亮的峰形和良好的分離度。實際操作中有些樣品堿性太強，進樣以后根本不成峰，低波長下細看似乎能感覺到基線一直在漂，開始時懷疑樣品濃度不夠，加大樣品濃度以后仍看不到樣品峰，流動相加入二乙胺或三乙胺以后再進樣，得到比較漂亮的樣品峰。
流動相里添加酸或者堿以后，基本上不會提供額外的選擇性，但是卻能提高分離度，因為峰形好了，相同的保留時間兩個峰之間的分離度自然就好了。但是流動相里添加酸或者堿以后，會在柱子上殘留，即使長時間用中性流動相沖洗也不會有什么效果，這一點在鍵合相手性柱上表現的尤為明顯。有時我們發現原來用中性流動相分離很好的一個偏酸性的樣品，柱子用過堿性流動相以后再用中性流動相去做，發現樣品峰不能達到基線分離，拖尾嚴重，甚至不成峰，這時可以往流動相里添加一滴酸，或者柱子用酸性流動相沖洗一下再用中性的流動相，一切又正常了，同理，用過酸性流動相的柱子去做弱堿性的樣品會有一樣的問題。殘留在柱子上的酸或堿是用堿或酸性的流動相來清洗，有條件的話盡量固定一只柱子只用酸性流動相或只用堿性流動相。
2、 方法優化
做手性分析時一般選用兩只柱子：AD-H和IC，基本上這兩只柱子可以解決遇到的所有的手性化合物，AD-H是早期我們一直在使用的，后來的IC 可以使用更多的溶劑從而提供了更多的選擇性，但是習慣先用AD-H做手性分析方法開發，手性分析基本上都用恒流來做，溶劑一般也都是提前混合好再放到儀器上用，主要是因為正相溶劑在儀器上混合效果不好。
如前邊所述，一般情況下拿到一個樣品，首先選擇的是用正己烷和乙醇做流動相，根據化合物分子結構式來判斷其極性的大小，進而來選擇流動相的比例，極性大的選擇使用的乙醇比例大一點，極性小的選擇使用的乙醇比例小一點，乙醇比例一般是從大到小，根據分離情況以5%或10%的比例遞減，一般要求*針至少能把樣品在相對較短的時間內從柱子上洗脫下來，然后再去做調整，如果開始的時候醇的比例選的過小，樣品可能在柱子上一兩個小時都洗不下來。消旋體出峰以后如果是一個峰，可以將峰放大，觀察有沒有分叉的跡象，有的話，可以通過適當的降低醇類的比例來進一步提高分離度，如果分得太開，可以適當的提高醇類的比例來縮短分析時間，通過對流動相比例的調整，使分析時間和分離度都能滿足手性分析的要求。如果樣品在使用一種醇類時沒有選擇性，即無論怎樣減小醇的比例樣品都沒有分離的跡象，可以換一種醇來試，通常乙醇和異丙醇會有不同的選擇性，很多樣品乙醇分不開，異丙醇能分離的很好。異丙醇也不行的時候可以嘗試在乙醇或者異丙醇里加入合適濃度的叔丁醇或者是甲醇，對于IC色譜柱可以嘗試其它如二氯甲烷、乙酸乙酯和甲苯等其它溶劑，每一種溶劑都能為手性分析提供*的選擇性，一般除了乙醇、異丙醇之外我使用zui多的還是叔丁醇，其次是甲醇，叔丁醇可以單獨和正己烷做流動相，甲醇必須結合乙醇或異丙醇混合使用。需要著重強調的是，更換醇的種類，有可能會導致對映異構體出峰順序的改變，使用乙醇的流動相，如果R構型先出峰，更換為異丙醇以后，有可能(不是一定)R構型會后出峰，S構型跑到前邊去了。
雖然提高柱溫能夠使峰形變窄變細，但是會降低分離度，而且大賽璐的手性柱溫度上限就是40度(這一點在超臨界流體色譜應用上受限尤為明顯)，所以優化分析方法時很少有人在柱溫上下功夫。另外手性柱分析樣品的保留時間受室溫變化的影響特別大，通常大家都習慣用消旋體圖譜計算對映異構體相對保留時間的方法根據主峰的保留時間來計算異構體的出峰位置。
